曾有人说他活不过十三岁，只有皈依佛才能闯过这一劫。为了防止意外发生，他到了六岁的时候，父母便把他送到上海法藏寺拜兴慈法师为师，法号乘培。1939年起，游本昌先后在上海、南京等地的小学读书，南京市考棚小学毕业后，曾就读于南京育群中学、商业职业学校、上海立信会计学校。1951年高中毕业，由南京市文联推荐加入南京文工团。1952年初随团调任上海华东人民艺术剧院演员，同年进入上海戏剧学院表演系学习。1956年毕业后，分配到中央实验话剧院任演员。1980年加入中国戏剧家协会。
1977年出演话剧《枫叶红了的时候》，饰演陆峥嵘。1979年出演话剧《大风歌》饰演吕产。1981年出演电视剧《孔乙己》，饰演孔乙己。1984年与虞梦出演童话电影《“下次开船”港游记》，在该影片中饰演洋铁人。1985年主演神话喜剧《济公》，在该剧中饰演助人为乐、劫富济贫的济公。1988年与王鹰共同主演剧情片《姑苏一怪》，饰演叶天士。2009年游本昌自导自演神话电视剧《了凡》，饰演云谷会禅师。2010年与王紫伊主演悬疑电影《济公古刹风云》，饰演济公；随后与薛之谦出演励志片《一只狗的大学时光》，饰演三轮车大爷；同年，与杨紫琼出演动作片《剑雨》，饰演行痴禅师。2011年与房祖名出演爱情片《李献计历险记》，饰演老李献计；同年，主演动作片《刀见笑》，饰演唐胖子。
2012年出演爱情片《画皮2》，饰演炼丹大师。2013年与郭涛出演青春爱情片《致命闪玩》，饰演老绅士；随后与吴孟达出演剧情片《大片》，饰演病人；同年，与张智霖出演爱情片《白狐》，饰演沙夜大师。
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